摘要:研究铁皮石斛的降血糖作用及其机制。方法:采用正常小鼠,肾上腺素性高血糖小鼠,链脲佐菌素性糖尿病(STZ-DM)大鼠,用放射免疫分析和免疫组化HRP-SPA染色等方法进行研究。结果:铁皮石斛对正常小鼠血糖及血清胰岛素水平无明显影响,但可使STZ-DM大鼠的血糖值降低、血清胰岛素水平升高、胰高血糖素水平降低。免疫组化染色显示,给药大鼠胰岛β细胞数量增多,α细胞数量减少。它还可使肾上腺素性高血糖小鼠血糖降低、肝糖原含量增高。结论:铁皮石斛对肾上腺素性高血糖小鼠及STZ-DM大鼠有明显的降血糖作用。其降血糖的胰内机制是促进胰岛β细胞分泌胰岛素,抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素,胰外机制可能是抑制肝糖原分解和促进肝糖原合成。

【关键词】:铁皮石斛;链脲佐菌素;血糖;胰岛素;胰高血糖素

糖尿病是一种胰岛素分泌绝对或相对不足引起的代谢性疾病,中医将它归入消渴证的范畴。

据《中药志》记载,石斛有“养阴益胃,生津止渴”的功效,在治疗糖尿病的中药方剂中也有的采用石斛,但未见对石斛单味中药降血糖的研究报道。对铁皮石斛的养阴生津作用,作者已作报道。本文研究铁皮石斛的降血糖作用,并探讨其降血糖作用的机制,为铁皮石斛及其制剂用于治疗糖尿病提供药理学依据。

1材料

1.1药物及试剂铁皮石斛浸膏,每克含生药1.8g。由浙江省天台县中药药物研究所提供。临用时用蒸馏水稀释成所需浓度,给药剂量均折合生药g·kg1表示。链脲佐菌素(STZ,批号89H0604,为美国Sigma公司产品。盐酸肾上腺素注射液,批号981127,为武汉制药厂产品。葡萄糖测定试剂盒由卫生部上海生物制品研究所供应。胰岛素及胰高血糖素放射免疫测定试剂盒,均为中国原子能科学研究院产品。豚鼠抗猪胰岛素抗血清,批号045C,为

丹麦Dako。公司产品,工作浓度1 :500。小鼠抗人胰高血糖素抗血清工作液,批号G-2654,美国Sigma公司产品。辣根过氧化酶标记葡萄球菌A蛋白(SRP-SPA,批号BA1080,武汉博士德公司产品,工作浓度1:500。

1.2动物NIH小鼠,雌雄各半,体重18 ~ 24 g; SD大鼠,含,体重180 ~ 240 g。均由浙江大学医学院实验动物中心提供。

2方法与结果

2.1铁皮石斛对正常小鼠血糖、血清胰岛素的影响

取小鼠30只,随机均分为3组,分别给生理盐水20 mL ·kg1和铁皮石斛0. 25,0. 5 g ·kg 1,ig。每天给药1次,连续3d,于末次给药后2h断头取血,用葡萄糖氧化酶法测血糖值,用放射免疫法测定胰岛素。结果表明,铁皮石斛0. 25,0. 5 g ·kg 1,ig后血糖和胰岛素水平变化不明显。 

 2.2铁皮石斛对肾上腺素性高血糖小鼠血糖及肝糖原含量的影响

小鼠40只,随机均分为4组,2个给药组分别给铁皮石斛各0. 5, 1. 0 g ·kg 1,ig,正常对照组和肾上腺素对照组给生理盐水20 mL·kg1,ig,每天1次,连续3d。于末次给药后70 min,两个给药组和肾上腺素对照组均以肾上腺素0 . 2 mg·kg1, sc, 50 min后断头取血测血糖,并迅速剖取肝脏,用碘试剂法测定肝糖原含量。

小鼠sc肾上腺素后血糖值明显升高,肝糖原含量明显降低(均为PG小于0. 001)。铁皮石斛0.5, 1.0g·kg1可使肾上腺素性高血糖小鼠的血糖值明显降低(PG小于0. 001),1. 0 g ·kg1组肝糖原含量比肾上腺素对照组明显增加(P小于0. 0l,)。

2.3铁皮石斛对STZ-DM模型大鼠血糖、血清胰岛素及胰高血糖素的影响大鼠禁食16h,称重,ipSTZ 70 mg·kg1, 72 h后剪尾取血,取血前禁食16 h,用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖值,取血糖值大于16 mmol ·L1的大鼠供试验用。将糖尿病大鼠随机均分为3组,每组6只。2组分别给铁皮石斛0. 125,0 . 5 g ·kg1,,ig; 1组为模型对照组,另设正常对照组,均给以等容量生理盐水。各组分别于给药后2h剪尾取血,分离血清,测血糖、胰岛素及胰高血糖素。结果表明,铁皮石斛0. 125, 0. 25 g·kg1, ig,均对STZ诱发的糖尿病大鼠有明显降血糖作用(P小于0. 001);铁皮石斛0.25 g ·kg1, ig,可使糖尿病大鼠胰岛素水平明显升高(P小于0.05),表明铁皮石斛能促进糖尿病大鼠胰岛俘细胞分泌胰岛素。铁皮石斛0. 125, 0. 25 g ·kg1, ig,可使糖尿病大鼠胰高血糖素水平明显降低(P小于0. O5与P小于0 . 01,表明铁皮石斛能抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素。

 2.4铁皮石斛对STZ-DM大鼠血糖及胰岛α,β细胞形态学的影响

2.4.1预防用药对STL-DM大鼠血糖及胰岛α,β细胞形态学的影响

大鼠12只,随机均分为2组,分别给铁皮石斛0.25 g·kg1,和生理盐水10 mL ·kg1, ig,每天2次,连续7d,于第5天上午给药后1 h ip·STZ 100 mg·kg1,给STZ 3 d后尾尖取血测空腹血糖值。从每组各取大鼠2只,颈椎脱位法处死,迅速剖取胰腺尾部,用4%多聚甲醛液固定,石蜡包埋,切片,进行胰岛素及胰高血糖素的免疫组织化学HRP-SPA法染色,以正常大鼠胰腺作为阳性对照,以Tris-HCl缓冲液代替第一抗体作为阴性对照,光镜下观察胰岛α,β细胞形态。结果表明,大鼠ip STZ100 mg · kg 11 3 d后,生理盐水对照组大鼠血糖值为(23 . 8± 2 . 2 ) mmol· L 1;铁皮石斛预防组血糖值为(14.9士7. 5 ) mmol· L 1,与生理盐水对照组比较有显著性差异(P小于0 . 05)。

胰岛素免疫组织化学染色后,表达胰岛素的免疫反应阳性产物为棕黄色颗粒,存在于免疫反应阳性β细胞胞质内。正常大鼠胰岛表达胰岛素的免疫反应阳性β细胞位于胰岛中央大部,阳性反应较强(图1)。省去第一抗体抗胰岛素血清的阴性对照切片染色结果为阴性,说明该染色为特异性。模型对照组在给STZ后3d,以及继续饲养1,2,4周时大鼠胰岛细胞完全呈阴性反应或仅有少数呈弱阳性(图2)。铁皮石斛预防组大鼠2只,血糖值分别为8 . 9,5. 2 mmol ·L1,胰腺免疫组化染色阳性β细胞数量比模型对照组为多,阳性反应比模型对照组为强,比正常对照组为弱。

胰高血糖素免疫组织化学染色显示,正常胰岛表达胰高血糖素的免疫反应阳性α细胞位于胰岛周边部,多数呈单层排列,棕黄色阳性产物位于胞质内,染色较浅(图5)。省去第一抗体抗胰高血糖素血清的阴性对照染色结果均为阴性,说明该染色为特异性。模型对照组在各个时间阳性细胞染色较深,且数量较多,有的α细胞由胰岛边缘部向中央部增生,呈宽带状分布(图6)。铁皮石斛预防组大鼠2只表达胰高血糖素的α细胞数量较模型对照组减少,呈小灶状分布于胰岛周边,阳性反应较模型对照组为弱。

2 .4.2治疗用药对STZ-DM大鼠血糖及胰岛α,β细胞形态学的影响大鼠24只,随机均分为3组。1组为正常对照组,另2组ip STZ 100 mg ·kg1, 3 d后造成糖尿病大鼠模型。治疗组以铁皮石斛0.25 g·kg1 ,ig,正常对照组和模型对照组以生理盐水10mL·kg1, ig,每天2次,连续给药4周。于给药1, 2,4周时,分别于次晨给药前取血测空腹血糖值,并分次每组取2只大鼠处死,迅速剖取胰尾固定,同上法制作组织切片进行免疫组织化学染色。

结果糖尿病模型对照组大鼠于1,2,4周时血糖值分别较正常对照组显著升高(P小于0. 001)。治疗组大鼠于2周和4周时,血糖值分别较相应的模型对照组大鼠血糖值为低,其中治疗2周时血糖值与模型对照组比较有显著性差异(P小于0.05 ), 4周时血糖值更低,因动物数少而未作统计学处理。

免疫组化染色结果显示,铁皮石斛治疗1周时,表达胰岛素的β细胞比模型对照组略为增多,但数量仍较少,阳照组减少,阳性反应较弱;阳性α细胞数量较模型对性反应比模型对照组减弱。与模型对照组比较β细胞数量增多,2周及4周阳性反应增但仍较正常对照组为弱(图4 );α细胞阳性反应较模型对照组减弱,已较接近正常对照组。

3讨论

3.1本研究结果表明,铁皮石斛能明显降低STZ-D M大鼠的血糖值,它能促进胰岛β细胞分泌胰岛素,提高血清胰岛素水平,并能抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素,使血清胰高血糖素水平降低。这说明该药可通过调节胰岛α,β细胞分泌的激素水平来发挥降血糖作用,具有胰内降血糖作用机制。铁皮石斛与口服降血糖药磺酞服类不同,它对小鼠正常血糖无降低作用,也不提高正常小鼠的血清胰岛素水平。

3.2本研究免疫组化染色结果显示,STL-DM大鼠胰岛β细胞基本上不表达胰岛素,提示iP100kg·kg1 STZ对大鼠胰岛β细胞具有严重的损伤作用,使胰岛素的合成和分泌减少,导致血中胰岛素水平明显降低,血糖值持续升高,至给STZ后4周仍维持高血糖状态。同时还观察到胰岛α细胞呈现明显的增生现象,使血中胰高血糖素水平明显升高,此与文献[5]报道相符。用铁皮石斛给大鼠预防和治疗用药,预防组和治疗组表达胰岛素呈阳性的胰岛β细胞数量增多,阳性反应较模型对照组为强,而表达胰高血糖素呈阳性的α细胞则数量减少,阳性反应比模型对照组明显减弱。以上结果说明该药对STZ诱发大鼠糖尿病具有一定的预防和治疗效果,提示对STZ引起的β细胞的损伤具有修复作用。由于大鼠不同时间作组织形态学观察的动物数较少,所得结果仅是初步的,有待进一步研究。

3.3铁皮石斛还可增加肾上腺素性高血糖小鼠的肝糖原含量,降低肾上腺素性高血糖小鼠的血糖值,可能该药具有抑制肾上腺素引起的肝糖原分解和促进肝糖原合成的作用,从而可减少血糖的来源,增加血糖的去路,降低小鼠的血糖值,故铁皮石斛也具有胰外的降血糖作用机制。关于铁皮石斛对糖代谢的影响,作者已作研究表明该药不具有促进葡萄糖氧化的作用。

3.4本研究采用高血糖小鼠和糖尿病大鼠模型,从血糖值、血清胰岛素和胰高血糖素水平,结合胰岛β细胞和α细胞的形态学变化等方面肯定了铁皮石斛具有明显降血糖作用,初步探讨了该药作用的胰内和胰外机制,此为铁皮石斛用于治疗糖尿病提供了药理学依据。已作毒性试验表明该药毒性很低,故具有开发降血糖新药的前景。

 

2017年11月29日

铁皮石斛对糖尿病的防治
铁皮石斛降血糖作用

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铁皮石斛降血糖作用及其机制的研究

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